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常规染色技术服务
点击次数:947 更新时间:2017-11-05 【打印此页】 【返回

固定

固定是组织学制片的关键步骤,为的是使欲观察的组织构造尽量接近它取材前的状态,使组织离体或死亡后不发生变化,细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分被转变为不溶性物质,避免自溶与腐败,并且令组织块硬化便于制片,同时能使各组分产生不同的折光率及对不同染料的亲和力,便于观察鉴别。因此标本取材后需及时放入固定液中,10%福尔马林溶液因其渗透力强、固定均匀、对组织收缩较少的特点,成为常规固定液。固定依标本大小决定浸泡时间,大标本可剖开固定。
因组织中含有较多水分,且水和石蜡不能互相溶解,因此不能直接进行石蜡包埋,还需经过某些溶剂逐步将组织块中的水分置换出来。脱水剂中最常用的是酒精。从75%酒精开始,逐步升高酒精浓度,直至无水乙醇。脱水时间应根据组织块的种类、大小及使用的固定液种类等因素而定。例如:45℃条件下,依次将标本浸泡于75%酒精、95% 酒精、无水乙醇I、无水乙醇II ,每道试剂浸泡30min。
大多数脱水剂不能与石蜡相溶,因此石蜡仍不能进入组织并包埋成供切片用的蜡块。为此,还需要一种桥梁作用的溶剂,既能溶于脱水剂又能和包埋剂相溶,以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。二甲苯是石蜡包埋中最常用的透明剂,不溶于水,易溶于无水乙醇,也是石蜡的溶剂。它的折光率为1.497,透明能力强但易使组织收缩变脆,因此不宜久留。例如:45℃条件下,二甲苯I中浸泡15min;二甲苯II中浸泡15min。为减少组织块过度收缩,可在无水乙醇之后,设一道乙醇二甲苯混合液。

浸蜡与包埋

浸蜡是指透明过的组织块在熔化的石蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替二甲苯,在随后的包埋中,由液态转变成固态,使整个组织具有均匀一致的固态结构和足够的硬度,以便切片机切片。浸蜡一般需要2-3h。
最常用的石蜡切片机是轮转式切片机,切片厚度在3 μm-5 μm之间,依组织细胞密度、细胞大小调整切片厚度。

H&E染色及封片

切片制成后,虽然能在光镜下隐约分辨出一些组织轮廓,但要很好的辨别它的细微结构是很困难的。HE染色是组织学中常规制片最基本也是应用最广泛的染色方法,用HE染色能显示各种组织的正常结构特点和病理时病变的发生、发展及修复情况,而且染色的切片存放时间长,因此很适用于观察、诊断或研究,在生物学和医学领域的教学、 科研、病理诊断等工作中有着不可或缺的作用。常用方法:烘片后二甲苯I 5min,二甲苯II 5min,二甲苯III 5min, 无水乙醇1min, 95%酒精1min, 75%酒精1min,自来水冲洗数秒逐步脱蜡至水,然后苏木素染3min,自来水冲洗数秒,分化液分化数秒后自来水冲洗返蓝,伊红染液染30s后逐步脱水,75%酒精30s, 95%酒精30s,无水乙醇 30s;然后用二甲苯透明1min。稍干后用中性树胶封片,晾干。